結構生物化學/蛋白質/純化/差速離心

目的：你有一些細胞中的蛋白質，然後你想去除其他蛋白質，得到你想要的蛋白質。

一般資訊

差速離心是一種根據質量分離細胞不同成分的方法。首先使用勻漿器破壞細胞膜，釋放細胞成分。所得混合物稱為勻漿液。將勻漿液離心以獲得含有最緻密細胞器的沉澱物。最緻密的化合物將在較低的離心速度下形成沉澱物，而密度較低的化合物很可能保留在沉澱物上方的液體上清液中。每次離心，上清液都可以在更快的速度下離心以獲得密度較低的細胞器。以逐步的方式進行離心，每次增加離心速度，可以根據質量分離成分。密度較高的細胞核最有可能在第一次離心步驟後出現，然後是線粒體，然後是更小的細胞器，最後是可能含有可溶性蛋白質的細胞質。

血液離心後的結果 - 化合物按重量分離。

平衡沉降使用溶液梯度根據每個粒子的密度（質量/體積）分離粒子。這種沉降的關鍵一點是它完全獨立於分子的形狀。它用於純化差速離心。製備一種溶液，其梯度最緻密的區域位於底部。然後將要分離的粒子新增到梯度中並離心。每個粒子繼續前進，直到到達密度相似的環境。這種密度梯度可以是連續的，也可以以增量方式製備。例如，當使用蔗糖製備密度梯度時，可以將 40% 蔗糖溶液小心地漂浮到 45% 蔗糖層上，並在其上新增更少的密度層。然後將製備在稀釋緩衝液中的勻漿液分層在頂部。離心後，通常在約 100,000 x g 下離心一個小時，可以觀察到由於密度變化而駐留在從一層到另一層的細胞成分的圓盤。透過小心地調整層密度以匹配細胞型別，可以富集特定的細胞成分。

平衡沉降非常有用，因為它不會形成沉澱物。旋轉速度會產生足夠的力使蛋白質離開轉子，但不會將其凝結成沉澱物。這是因為產生了蛋白質濃度梯度。擴散會對梯度產生反應，在一定時間後，沉降和擴散之間會達到完美的平衡。

平衡沉降在研究蛋白質之間的相互作用方面也很實用。特別是用於確定蛋白質的天然狀態或天然構象。天然狀態告訴我們蛋白質的三維結構。此資訊包括它是單體、二聚體、三聚體、四聚體等。單體是隻由一個亞基組成的蛋白質。二聚體是兩個旋轉 180 度的蛋白質亞基。三聚體是三個亞基等等。這種型別的實驗也讓我們可以確定蛋白質是否可以形成寡聚體（相同的肽鏈構成蛋白質的兩個或多個單元）。此外，平衡沉降的使用在於它確定蛋白質-蛋白質和蛋白質-配體相互作用的平衡常數。這個 Kd 的值通常在 1nM-1mM 之間。這是透過測量平衡常數 (Kd) 計算得出的。最後，平衡沉降可以用來確定蛋白質複合物之間的化學計量比。這方面的例子是配體及其受體或抗原-抗體對。

參考文獻

Durdik, Jeaninne。 "平衡沉降"。聯盟蛋白實驗室. 檢索於 2009-10-10.