結構生物化學/蛋白質/純化/親和層析

親和層析是一種可應用的技術，用於純化蛋白質。它基於蛋白質對特定化學基團的高親和力的優勢進行。親和層析是由 Pedro Cuatrecasas 和 Meir Wilcheck 在 1968 年發現的。

此過程通常用於從蛋白質池中分離感興趣的蛋白質。一個柱子裝滿了含有共價連線的葡萄糖殘基的珠子。考慮到這些殘基是根據目標蛋白質選擇的。當蛋白質混合物倒入柱子時，蛋白質會穿過珠子向下流動。目標蛋白質將被識別並透過共價鍵捕獲到柱子上，因為它對葡萄糖具有親和力。其餘的蛋白質將向下流到柱子並被分離。需要新增到柱子中的緩衝液部分用於完全洗脫未結合的蛋白質。最後，新增濃縮的葡萄糖溶液以將目標蛋白質與柱子連線的葡萄糖殘基分離。

起始部分包含溶液中未定義的異質分子混合物。所需分子將具有定義的特性，這些特性可以在親和純化過程中被利用。該過程是一個設定，其中目標分子被捕獲在固定介質上。非目標異質混合物由於其無結合能力而不會被捕獲。然後可以將固體介質從混合物中去除，多次洗滌，然後在稱為洗脫的過程中以高濃度的特定化學物質釋放目標分子或改變條件以降低結合能力。此外，重要的是反應在合適的 pH 值下進行；否則，它可能會降低親和力並改變蛋白質的構象，從而阻止目標蛋白質按預期與殘基結合。

親和層析是一種分離轉錄因子的強大方法，轉錄因子是透過與特定DNA序列結合來調節基因表達的蛋白質。將蛋白質混合物透過含有連線到基質上的特定 DNA 序列的柱子滲透。對該序列具有高親和力的蛋白質將結合並被保留。在這種情況下，轉錄因子透過用含有高濃度鹽的溶液洗滌來釋放。

一般來說，親和層析可以有效地用於分離識別 X 基團的蛋白質：將 X 或其衍生物共價連線到柱子上，將蛋白質混合物新增到該柱子上，然後用緩衝液洗滌以去除未結合的蛋白質，然後透過新增高濃度的 X 的可溶性形式或改變條件以降低結合親和力來洗脫所需的蛋白質。當蛋白質與用作誘餌的分子之間的相互作用高度特異時，親和層析最有效。

利用

親和層析主要用於生物化學領域

• 從混合物中純化特定蛋白質

• 減少多種蛋白質混合物中特定蛋白質分子的數量

• 發現物質對生物化合物的親和力，在本例中為蛋白質。

組合化學

親和層析也可以用於組合化學（體外進化），其中您可以透過建立大量分子並選擇特定功能來模仿進化過程。在這種情況下，您從多種分子群體開始，然後選擇特定的蛋白質，並複製該分子。例如，從隨機的 RNA 片段池和 ATP 親和柱開始，您將 RNA 池應用到柱子的頂部。接下來，您將允許選擇 ATP 結合分子，從 RNA 池中洗脫所有未與 ATP 結合的片段。然後，為了洗脫結合的 RNA 分子，您將 ATP 應用到柱子的頂部。這將分離與 ATP 結合的選定 RNA 分子。您可以透過使用不同的鹽濃度來擴充套件這種選擇，增加的鹽濃度更具選擇性。

免疫親和層析

免疫親和層析的一個例子是使用血液抗體。血液抗體可以透過使用親和純化從血漿（血清）中純化。如果血漿中存在針對某些特定抗原的抗體，我們可以使用它透過親和力進行抗原純化。一個常見的例子是觀察生物體是否對 GST 融合蛋白具有免疫力，方法是觀察它是否產生針對 GST 標籤和融合蛋白的抗體。首先，允許 GST 親和基質與血漿結合。允許血漿結合有助於去除針對 GST 的抗體。將血漿與固體分離有助於它與 GST 融合蛋白基質結合，這反過來又會將抗體在固體支援物中識別的抗原捕獲在其中。使用低 pH（pH 3）緩衝液進行洗脫有助於獲得所需的抗體。洗脫液的收集大多在磷酸鹽緩衝液中完成，以中和低 pH。

固定化金屬離子親和層析 (IMAC)

IMAC 特別基於氨基酸與金屬形成共價鍵的配位。此技術的概念是在柱中保留對金屬離子具有親和力的蛋白質，這些金屬離子被固定在柱子內部。鐵、鎵或鋅可用於純化磷酸化蛋白質或肽。用於結合組氨酸的常見金屬是銅、鈷和鎳。由於許多天然存在的蛋白質對金屬離子沒有親和力，因此使用 DNA 重組技術。

相互作用材料

這些是自然界中典型的生化相互作用，已廣泛用於親和層析

• 酶將與底物類似物、抑制劑和輔因子結合

• 凝集素將與多糖、糖蛋白、細胞表面受體、細胞結合

• 抗體將與抗原、病毒、細胞結合

• 核酸將與互補鹼基序列、組蛋白、核酸聚合酶和核酸結合蛋白結合

• 激素、維生素將與受體、載體蛋白結合

• 谷胱甘肽將與谷胱甘肽-S-轉移酶或 GST 融合蛋白結合

• 金屬離子將與多（His）融合蛋白、其表面具有組氨酸、半胱氨酸和色氨酸殘基的天然蛋白質結合。

第一種技術

通常，親和層析將透過柱層析進行。首先，必須研究蛋白質的結合能力。然後，用結合材料修飾的固體介質裝入層析柱中。然後，將包含所需蛋白質的初始混合物透過柱子新增，以允許結合發生。逐漸向混合物的新增物中新增洗滌緩衝液。洗脫緩衝液隨後將未結合的蛋白質從柱子中去除並收集。

洗脫方法

對於所有的親和介質，沒有通用的洗脫方法。當物質與親和介質緊密結合時，在繼續洗脫過程之前，在施加洗脫液後停止流動可能是有益的，通常為 10 分鐘到 2 小時。額外的等待時間有助於提高結合蛋白的回收率。

維持底物與結合物質複合物的力包括靜電相互作用、疏水相互作用和氫鍵。預計破壞這些相互作用的試劑將作為有效的洗脫劑發揮作用。實現效率的最佳流速可能因特定的相互作用而異。

pH 洗脫方法

這是最常用的技術之一，用於從配體中去除結合的蛋白質。pH 值的變化會改變配體和/或結合蛋白質上的帶電基團。這種變化可能會直接影響結合位點並降低其親和力。另一方面，pH 值的變化可以透過改變蛋白質構象而間接改變親和力。突然降低 pH 值是最常用的洗脫結合蛋白質的方法之一。配體和靶蛋白的化學穩定性決定了 pH 值變化的限制。洗脫後，色譜柱應立即恢復至中性 pH 值，以避免蛋白質發生不可逆的變性。

離子強度變化方法

改變緩衝溶液的離子強度會改變配體和靶蛋白之間的特異性相互作用。這種方法是一種溫和的洗脫方法，使用離子強度更高的緩衝液（通常是氯化鈉），以線性梯度或分步方式施加。

競爭性試劑洗脫

選擇性洗脫液通常用於在特定介質上或在配體/靶蛋白相互作用具有高結合親和力的情況下分離物質。洗脫劑與靶蛋白或配體競爭結合。這是自然界中競爭性抑制劑的一個例子。物質可以透過單一洗脫液的濃度梯度洗脫。在這種方法中，競爭性試劑的濃度應與偶聯配體的濃度相等。但是，如果遊離競爭性化合物與配體與靶蛋白的結合較弱，則使用更高濃度的競爭性試劑來實現洗脫效率。

例如競爭性親和色譜，有 R1a 蛋白。靶蛋白 R1a 與 cAMP 樹脂結合。R1a 蛋白與 cAMP 之間的相互作用可以使用 cGMP 洗脫緩衝液分離。該 cGMP 與靶蛋白競爭，但是含有高濃度 cGMP 的洗脫緩衝液將與樹脂結合得更多。分離的 R1a 蛋白將被洗脫出來。

降低洗脫液極性

使用條件降低洗脫液的極性，以促進洗脫而不使蛋白質失活。二惡烷或乙二醇是這類洗脫液的典型代表。

混亂劑洗脫液

如果其他洗脫方法失敗，可以使用改變蛋白質結構的變形緩衝液來實現配體和靶蛋白的分離。典型的混亂劑是鹽酸胍和尿素。雖然這種方法將產生最高的回收率，但應儘可能避免使用混亂劑方法，因為它們會使洗脫的蛋白質變性。

組氨酸標籤

親和色譜可以使用多種不同的蛋白質標籤進行。實驗室中常用的標籤之一是聚組氨酸。它的長度較短，不會改變標記蛋白質的構象。組氨酸標記是有利的，因為它非常特異，允許高度純化。

編碼特定蛋白質的基因首先被修飾以包含該標籤。可以在表達蛋白的氨基或羧基末端新增一串組氨酸殘基。然後將標記的蛋白質透過一個裝有共價連線的、固定化的鎳（II）（Ni 2⁺。）的珠子的色譜柱。組氨酸標籤與固定化的金屬離子緊密結合，因為組氨酸的側鏈（咪唑）對金屬離子（在本例中為鎳 II）具有特異性結合親和力。結果，所需的蛋白質緊密結合到珠子上，而其他蛋白質輕鬆地流出色譜柱。即使其他不想要的蛋白質（具有組氨酸側鏈）也會流出色譜柱，因為它們不像所需的標記蛋白質那樣多，後者大約有 6 個相鄰的組氨酸殘基。然後可以透過新增咪唑或其他一些與金屬離子結合並置換蛋白質的化學物質來從色譜柱中洗脫蛋白質。可以透過酶聯免疫吸附測定 (ELISA) 驗證所需蛋白質的存在。

鎳樹脂再生

在重組 DNA 中，所需蛋白質上的組氨酸標籤和鎳樹脂通常用於透過親和色譜來純化所需的蛋白質。也就是說，組氨酸對鎳樹脂具有很強的親和力，不會流出色譜柱。不想要的蛋白質沒有設計的組氨酸序列，因此無法與鎳樹脂結合；這些蛋白質流出色譜柱。在洗脫過程中，我們添加了相對高濃度的咪唑緩衝液。咪唑與我們所需的蛋白質競爭與鎳樹脂結合。在實踐中，鎳樹脂相當昂貴。鎳樹脂的再生至關重要。它涉及幾個步驟。首先，可能存在一些剩餘蛋白質殘留在用過的鎳樹脂上；這些剩餘蛋白質使用鹽酸胍和相應的緩衝液變性並洗掉。用 Milli Q 水和濃度逐漸增加的乙醇洗滌鎳樹脂。鎳樹脂再生的一個重要步驟是重新充電鎳。我們首先用 EDTA 去除鎳，EDTA 是一種六齒化合物，可以釋放鎳離子。然後樹脂會變成白色，沒有鎳。然後用高濃度的鎳鹽重新充電樹脂，以獲得我們略帶綠色的樹脂。

谷胱甘肽 S-轉移酶 (GST) 標籤

GST 對谷胱甘肽具有親和力，谷胱甘肽以固定化的谷胱甘肽瓊脂糖的形式提供。使用過量的谷胱甘肽來置換標記的蛋白質以進行洗脫。與組氨酸標籤一起，純化 GST 標籤等重組蛋白是親和色譜最常見的用途。

GST 是參與細胞防禦電性化合物的一種酶。它具有高親和力和特異性與谷胱甘肽結合。這種相互作用的強度和選擇性允許透過基於谷胱甘肽的蛋白質樹脂來純化 GST 標記的蛋白質。谷胱甘肽樹脂有效地選擇性結合 GST 標記的蛋白質，允許感興趣的特異性蛋白質以高效率從混合物中分離出來。

GST 是一種 35-KDa 蛋白，它具有小的肽。正是這種特性使人們能夠快速進行 GST-蛋白質純化，而不會被蛋白酶降解並最大程度地減少樣品損失。GST 在變性時將失去與谷胱甘肽樹脂結合的能力，因此，不能在緩衝液中新增強變性劑（如鹽酸胍和尿素）。

凝集素親和色譜

凝集素蛋白，例如最初從刀豆 Canavalia ensiformis 中提取的刀豆蛋白 A，特異性結合糖中某些特定的結構。凝集素親和色譜是一種親和色譜，其中植物蛋白刀豆蛋白 A 透過將粗提物透過裝有共價連線的葡萄糖殘基的珠子的色譜柱來純化。由於它對葡萄糖具有親和力，刀豆蛋白 A 將與這種型別的色譜柱結合。然後新增濃縮的葡萄糖溶液以從色譜柱上除去結合的刀豆蛋白 A。

優點和缺點

優點

• 親和層析是一種相當可行的技術，因為葡萄糖殘基和目標蛋白具有很高的選擇性，從而獲得了高回收率的純化產物。

1• 在許多情況下，它可以是一個單步過程。

2• 該技術可用於低濃度物質。

3• 實現了快速分離，同時避免了汙染。

4. 與凝膠過濾層析和離子交換層析不同，親和層析能夠一次分離一種特定蛋白質，而其他技術會分離具有相似特性的蛋白質。

缺點

• 必須仔細確定目標蛋白與配體的相互作用。此過程需要昂貴的材料、時間，並且一次只能處理少量蛋白質。

參考文獻

生物化學，Berg，第六版，ISBN 0-7167-8724-5

Clontech,http://www.clontech.com/products/detail.asp?product_id=10594&tabno=2