結構生物化學/蛋白質/純化/親和層析
親和層析是一種可用於純化蛋白質的技術。它利用蛋白質對特定化學基團的高親和性來進行。親和層析是由 Pedro Cuatrecasas 和 Meir Wilcheck 在 1968 年發現的。
此過程通常用於從蛋白質池中分離目標蛋白。一個柱子裝滿了帶有共價連線的葡萄糖殘基的珠子。需要考慮的是，這些殘基的選擇要與目標蛋白相對應。當蛋白質混合物被倒入柱子中時，蛋白質會透過珠子向下移動。由於目標蛋白對葡萄糖的親和性，它會被識別並透過共價鍵捕獲到柱子上。其餘蛋白質會繼續向下移動並被分離。需要向柱子中新增一部分緩衝液，以完全洗脫未結合的蛋白質。最後，新增濃縮的葡萄糖溶液，以將目標蛋白從柱子上連線的葡萄糖殘基中分離出來。
起始部分包括溶液中未定義的異質分子混合物。所需的分子將具有在親和純化過程中可利用的定義性質。該過程的設定是目標分子被捕獲在固定介質上。非目標異質混合物由於其未結合的能力而不會被捕獲。然後可以從混合物中去除固體介質，洗滌多次，並且目標分子在稱為洗脫的過程中從捕獲中釋放出來，該過程使用高濃度的特定化學物質或改變條件以降低結合能力。此外，重要的是反應在合適的 pH 值下進行；否則，它可能會降低親和力並改變蛋白質的構象，從而阻止目標蛋白按預期與殘基結合。
親和層析是分離轉錄因子的有力手段，轉錄因子是透過與特定DNA序列結合來調節基因表達的蛋白質。蛋白質混合物透過包含連線到基質上的特定 DNA 序列的柱子滲透。對序列具有高親和力的蛋白質將結合並被保留。在這種情況下，轉錄因子透過用含有高濃度鹽的溶液洗滌來釋放。
一般來說，親和層析可以有效地用於分離識別 X 基團的蛋白質，方法是：將 X 或其衍生物共價連線到柱子上，將蛋白質混合物新增到此柱子上，然後用緩衝液洗滌以去除未結合的蛋白質，然後透過新增高濃度的可溶形式的 X 或改變條件以降低結合親和力來洗脫所需的蛋白質。當蛋白質與用作誘餌的分子之間的相互作用高度特異時，親和層析最有效。
親和層析主要用於生物化學中
• 從混合物中純化特定蛋白質
• 減少多種蛋白質混合物中特定蛋白質分子的數量
• 發現物質對生物化合物（在本例中為蛋白質）的親和力。
親和層析也可用於組合化學（體外進化），其中你可以透過建立大量的分子並選擇特定功能來模仿進化過程。在這種情況下，你從多種分子的群體開始，然後選擇特定的蛋白質，並複製該分子。例如，從隨機的 RNA 片段庫和一個 ATP 親和柱開始，你會將 RNA 庫應用到柱子的頂部。接下來，你會允許選擇 ATP 結合分子，從 RNA 庫中洗脫所有未結合到 ATP 的片段。然後為了洗脫結合的 RNA 分子，你會將 ATP 應用到柱子的頂部。這將分離出與 ATP 結合的選擇性 RNA 分子。你可以透過使用不同的鹽濃度來擴充套件這種選擇，更高的鹽濃度更具選擇性。
免疫親和層析的一個例子是使用血液抗體。血液抗體可以透過從血液血漿（血清）中使用親和純化來純化。如果血漿中存在針對某種特定抗原的抗體，我們可以利用親和力來純化該抗原。一個常見的例子是觀察生物體是否對 GST 融合蛋白具有免疫力，方法是觀察其是否產生針對 GST 標籤和融合蛋白的抗體。首先，讓 GST 親和基質與血漿結合。讓血漿結合有助於去除針對 GST 的抗體。將血漿從固體中分離出來有助於它與 GST 融合蛋白基質結合，而 GST 融合蛋白基質反過來又會捕獲固體支援物中被抗體識別的抗原。使用低 pH（pH 3）緩衝液洗脫有助於獲得所需的抗體。洗脫液的收集主要是在磷酸鹽緩衝液中進行，以中和低 pH。
IMAC 特別基於氨基酸與金屬形成的配位共價鍵。這種技術的概念是在柱子中保留對金屬離子具有親和力的蛋白質，這些金屬離子被固定在柱子內部。鐵、鎵或鋅可用於純化磷酸化蛋白質或肽。用於結合組氨酸的常見金屬是銅、鈷和鎳。由於許多天然存在的蛋白質對金屬離子沒有親和力，因此使用 DNA 重組技術。
這些是自然界中典型的生化相互作用，在親和層析中得到了廣泛的應用
• 酶將與底物類似物、抑制劑和輔因子結合
• 凝集素將與多糖、糖蛋白、細胞表面受體、細胞結合
• 抗體將與抗原、病毒、細胞結合
• 核酸將與互補鹼基序列、組蛋白、核酸聚合酶和核酸結合蛋白結合
• 激素、維生素將與受體、載體蛋白結合
• 谷胱甘肽將與谷胱甘肽-S-轉移酶或 GST 融合蛋白結合
• 金屬離子將與多（His）融合蛋白、表面具有組氨酸、半胱氨酸和色氨酸殘基的天然蛋白質結合。
通常，親和層析透過柱層析進行。首先，必須研究蛋白質的結合能力。然後，將用結合材料修飾的固體介質填充到層析柱中。接著，將含有目標蛋白質的起始混合物透過柱子，使其發生結合。然後逐漸新增洗滌緩衝液。洗脫緩衝液隨後將未結合的蛋白質從柱中去除並收集。
並非所有親和介質都適用通用洗脫方法。當物質與親和介質緊密結合時，在繼續洗脫過程之前，在施加洗脫液後停止流動可能有用，通常需要 10 分鐘到 2 小時。這額外的等待時間有助於提高結合蛋白質的回收率。
維持底物和結合物質複合體的力包括靜電相互作用、疏水相互作用和氫鍵。預計破壞這些相互作用的試劑可以作為有效的洗脫劑。為了達到效率，最佳流速可能因特定相互作用而異。
這是最常用的從配體中去除結合蛋白質的技術之一。pH 值的變化會改變配體和/或結合蛋白質上的帶電基團。這種變化可能會直接影響結合位點並降低其親和力。另一方面，pH 值的變化可以透過改變蛋白質的構象而間接改變親和力。突然降低 pH 值是洗脫結合蛋白質最常用的方法之一。配體和目標蛋白質的化學穩定性決定了 pH 值變化的限制。洗脫後，應立即將柱子恢復到中性 pH 值，以避免蛋白質不可逆地變性。
改變緩衝液溶液的離子強度將改變配體和目標蛋白質之間的特定相互作用。這種方法是一種溫和的洗脫，使用離子強度增加的緩衝液（通常是氯化鈉），以線性梯度或分步方式應用。
選擇性洗脫劑通常用於分離特定介質上的物質，或在配體/目標蛋白質相互作用的高結合親和力存在的情況下。洗脫劑競爭性地與目標蛋白質結合或與配體結合。這是自然界中發生的競爭性抑制劑的一個例子。物質可以透過單一洗脫劑的濃度梯度洗脫。在這種方法中，競爭性試劑的濃度應與偶聯配體的濃度相等。但是，如果遊離競爭性化合物與配體對目標蛋白質的結合力較弱，則使用更高濃度的競爭性試劑才能實現洗脫效率。
例如，競爭性親和層析中，有一種 R1a 蛋白。目標 R1a 蛋白與 cAMP 樹脂結合。R1a 蛋白與 cAMP 之間的相互作用可以使用 cGMP 洗脫緩衝液分離。這種 cGMP 與目標蛋白競爭，但是含有高濃度 cGMP 的洗脫緩衝液將更多地與樹脂結合。分離的 R1a 蛋白將被洗脫出來。
使用條件降低洗脫劑的極性，促進洗脫，而不會使蛋白質失活。二惡烷或乙二醇是這類洗脫劑的典型代表。
如果其他洗脫方法失敗，可以使用變形緩衝液溶液（改變蛋白質結構）來實現配體和目標蛋白質的分離。典型的破壞性試劑是鹽酸胍和尿素。雖然這種方法將產生最高的回收率，但應儘可能避免使用破壞性試劑，因為它們會使洗脫的蛋白質變性。
親和層析可以使用多種不同的蛋白質標籤進行。實驗室中常用的標籤之一是多組氨酸。它的長度很短，不會改變標記蛋白質的構象。組氨酸標記非常有利，因為它非常特異，可以實現高水平的純化。
編碼特定蛋白質的基因首先被修飾以包含標籤。可以在表達蛋白質的氨基或羧基末端新增一串組氨酸殘基。然後將標記的蛋白質透過包含共價連線的固定化鎳（II）（Ni 2+）的珠子柱。組氨酸標籤與固定化的金屬離子緊密結合，因為組氨酸的側鏈咪唑對金屬離子（在本例中為鎳 II）具有特定的結合親和力。因此，目標蛋白與珠子緊密結合，而其他蛋白則很容易透過柱子。即使其他不希望的蛋白質含有組氨酸側鏈，它們也會透過，因為它們不像目標標記蛋白那樣多，目標標記蛋白大約有 6 個相鄰的組氨酸殘基。然後可以透過新增咪唑或其他一些與金屬離子結合並置換蛋白質的化學物質，將蛋白質從柱中洗脫出來。可以透過酶聯免疫吸附測定 (ELISA) 驗證目標蛋白質的存在。
鎳樹脂再生
在重組 DNA 中，目標蛋白上的組氨酸標籤和鎳樹脂通常用於透過親和層析純化目標蛋白。也就是說，組氨酸對鎳樹脂具有很強的親和力，因此不會透過柱子。不希望的蛋白質沒有設計的組氨酸序列，因此無法與鎳樹脂結合；這些蛋白質會透過柱子。在洗脫過程中，我們新增相對高濃度的咪唑緩衝液。咪唑與目標蛋白競爭與鎳樹脂結合。在實踐中，鎳樹脂相當昂貴。鎳樹脂的再生至關重要。它包括幾個步驟。首先，可能在使用過的鎳樹脂上殘留一些蛋白質；這些殘留的蛋白質使用鹽酸胍和相應的緩衝液變性並洗掉。鎳樹脂用 Milli Q 水和濃度逐漸增加的乙醇洗滌。鎳樹脂再生中一個重要的步驟是重新充電鎳。我們首先用 EDTA（六齒化合物）去除鎳， EDTA 會釋放鎳離子。然後樹脂會變成白色，沒有鎳。然後用高濃度的鎳鹽對樹脂進行重新充電，得到我們略帶綠色的樹脂。
GST 對谷胱甘肽具有親和力，谷胱甘肽可作為谷胱甘肽瓊脂糖固定化。使用過量的谷胱甘肽來置換標記的蛋白質以進行洗脫。除了組氨酸標籤之外，純化重組蛋白（如 GST 標籤）是親和層析最常見的用途。
GST 是參與細胞防禦電氣化合物的一種酶。它對谷胱甘肽具有很高的親和力和特異性。這種相互作用的強度和選擇性允許用谷胱甘肽基蛋白樹脂純化 GST 標記的蛋白質。谷胱甘肽樹脂有效地選擇性地結合 GST 標記的蛋白質，使感興趣的特定蛋白質能夠從混合物中高效分離。
GST 是一種 35-KDa 蛋白，它具有小的肽。正是這種特性使得人們能夠快速進行 GST-蛋白質純化，而不會被蛋白酶降解，並且可以最大限度地減少樣品損失。GST 在變性時會失去與谷胱甘肽樹脂結合的能力，因此，在緩衝液中不能新增強變性劑，如鹽酸胍和尿素。
凝集素蛋白，例如刀豆蛋白 A，最初是從刀豆屬植物 *Canavalia ensiformis* 中提取的，它能特異性地結合糖類中某些特定的結構。凝集素親和層析是一種親和層析，其中透過將粗提物透過包含共價連線的葡萄糖殘基的珠子柱來純化植物蛋白刀豆蛋白 A。由於它對葡萄糖具有親和力，刀豆蛋白 A 將與這種型別的柱子結合。然後新增濃縮的葡萄糖溶液，以將結合的刀豆蛋白 A 從柱子中去除。
• 親和層析是一種相當可行的技術，因為葡萄糖殘基和目標蛋白之間具有高度的選擇性，從而產生了高回收率的純化產物。
1• 在許多情況下，它可以是一個步驟的過程。
2• 該技術可用於低濃度物質。
3• 在避免汙染的同時實現快速分離。
4. 與凝膠過濾層析和離子交換層析不同，親和層析可以一次分離一種特定蛋白，而其他技術則分離具有相似特性的蛋白。
• 必須仔細確定目標蛋白和配體的相互作用。這個過程需要昂貴的材料、時間以及少量的一次性處理蛋白質。
生物化學，Berg，第 6 版，ISBN 0-7167-8724-5
Clontech，http://www.clontech.com/products/detail.asp?product_id=10594&tabno=2