結構生物化學/蛋白質/酶聯免疫吸附測定 (ELISA)
酶聯免疫吸附測定 (ELISA) 是一種分析方法，利用各種 抗體 檢測溼樣或液體樣品中化合物的存在。 酶 與抗體結合，與底物反應，產生顏色變化，表明所需物質（通常是抗原）的存在。顏色強度可用於確定樣品中目標物質的濃度。抗體被分析以形成僅檢測所需抗原或蛋白質的單克隆抗體純系。
如果抗體標記的酶對另一種抗體具有特異性，則使用間接 ELISA 方法，而如果抗體標記的酶可以直接與抗原反應，則優選使用夾心法。
- 目的：檢測一種型別的抗體的存在。
- 步驟
- 用抗原包被樣品孔。
- 將樣品新增到包被孔中。如果樣品中存在目標抗體 (抗體 A)，它將與抗原結合。洗去剩餘的樣品。
- 將第二抗體 (抗體 B) 新增到樣品中。抗體 B 是一種專門與抗體 A 結合的抗體，並與特殊酶相連。洗去剩餘的抗體 B。
- 將底物新增到混合物中。這種底物將觸發與連線到抗體 B 的酶的反應，產生有色物質。
- 顏色變化的速度與溶液中抗體的量成正比。
- 用途：HIV 感染測試
在夾心 ELISA 或雙位點捕獲測定中，使用兩種不同的抗體。孔用針對抗原的一個區域的特異性抗體包被，然後新增含有抗原的測試溶液。洗滌後，將識別抗原不同表位的第二抗體新增。這種抗體將與酶連線。
- 目的：檢測一種型別的抗原的存在。
- 步驟
- 用對一種型別的抗原有特異性反應的單克隆抗體 (抗體 Z) 包被樣品孔。
- 將可能含有目標抗原 (抗原 C) 的樣品新增到包被的樣品孔中。如果樣品含有抗原 C，它將與抗體 Z 結合。洗去剩餘的樣品。
- 將第二種單克隆抗體 (抗體 Y) 新增到孔中，該抗體也與抗原 C 結合。這種抗體與特殊酶相連。
- 新增與抗體 Y 上的酶反應的底物。發生反應並觀察到顏色變化。
- 有色產物的存在證實了抗原 C 的存在。有色產物的強度可用於確定抗原 C 的濃度。此外，溶液的顏色變化速率與抗原的量成正比。
- 夾心 ELISA 的應用：妊娠測試
在妊娠測試中，反應區將包含識別妊娠激素稱為人絨毛膜促性腺激素 (HCG) 的獨特β鏈一部分的主要抗體（通常是單克隆小鼠抗體 IgG）。測試區中與酶結合的二級抗體識別α鏈。這種鏈可以在非孕婦婦女中發現的黃體生成素 (LH) 中發現。如果抗原與兩種抗體結合形成夾心，它將在該測試區顯示顏色變化。最後，對照區含有與主要抗體（抗 IgG）結合的抗體。該區出現顏色變化將表明我們的測試已正確執行。
競爭性 ELISA 是另一種 ELISA 方法，它涉及競爭性結合過程。
- 步驟
- 在抗原存在的情況下孵育未標記的抗體。
- 將結合的抗體/抗原新增到抗原包被的孔中。
- 洗滌並去除未結合的抗體。
- 競爭源於這樣一個事實：樣品中存在的抗原越多，能夠結合的抗體就越少。
- 新增與酶偶聯的第二抗體。
- 新增底物以產生訊號
- 釋放的訊號越弱（顏色或熒光訊號），表明原始抗原濃度越高。
反向 ELISA 是一種相對較新的技術，專門用於研究西尼羅病毒包膜蛋白以及它如何檢測病毒特異性抗體。這種較新的技術使用由具有 ogives 的免疫吸附聚苯乙烯棒製成的固相。將整個裝置浸入含有收集的樣品的試管中，然後執行以下常規步驟，例如洗滌、在結合物中孵育和在顯色劑中孵育，方法是將微孔浸入含有製備的樣品濃度的溶液中。
反向 ELISA 相對於其他 ELISA 技術的優勢在於該測試能夠檢測不同試劑的靈敏度，這對於檢測具有大目標檢測的不同型別的抗體及其各自的抗原非常有利。可以增加樣品量以提高臨床（唾液、尿液）、食品（散裝牛奶、混合雞蛋）和環境（水）樣品的測試靈敏度。留出一個 ogive 不敏感，以測量樣品的非特異性反應。無需使用實驗室用品來分配樣品等份、洗滌液和試劑到微孔中，從而簡化了即用型實驗室試劑盒和現場試劑盒。基於 ELISA 平臺，該方法使用抗體微陣列來捕獲天然抗原。然後透過對患者 IgG 進行差異標記，並將這些抗體與固定在抗體微陣列上的天然抗原一起孵育來評估自身抗體的反應性。
- 步驟
- 準備：準備從血清中分離和純化的自身抗體 (IgG)。透過放射性標記或熒光染料對它們進行標記。
- 提取：用陣列上的天然蛋白質標記自身抗體。透過獨特的單克隆抗體從微陣列中提取與陣列上抗體結合的天然抗原。應將陣列與天然蛋白質提取物（如細胞、組織或體液等）一起孵育。
- 分析：根據出現在測定中的染料的強度分析濃度。當過程完成後，然後透過其顏色強度評估測定，該顏色強度是針對每個孔確定的。產生的顏色量與結合到微孔底部的蛋白質上的主要抗體量相關。