結構生物化學/蛋白質/使用光譜法測量酶活性
酶是強大的生物學催化劑。催化劑可以加速反應，但不會在反應中消耗。因此，酶對於消化等身體功能至關重要，因為如果沒有酶，這些反應將在身體無法承受的過高溫度下進行。催化過程發生在活性位點。酶對它們的反應物或底物以及它們參與的化學反應型別具有極高的選擇性。這是由於酶和底物之間形狀、電荷和特徵的相似性。將酶和底物結合在一起被稱為酶-底物 (ES) 複合物。
透過實驗分析觀察到，酶促過渡態經常使用動力學同位素效應來理解反應物與過渡態中發現的中間體之間的鍵合差異。動力學同位素效應是指給定反應中兩種不同同位素標記分子的反應速率之比。除了過渡態之外，酶在作為常見的藥物靶標方面也發揮著重要作用，因為許多藥物充當酶抑制劑。酶最常見的特徵是它們能夠催化反應並提高反應速率。它們還可以透過將較大的單個過渡態能壘分解並建立多個較小的能壘步驟來克服較大的單個過渡態能壘。反應速率還受到蛋白質中發生的構象變化以及反應物釋放產生產物的速率的限制。此外，動力學同位素效應的值，通常是內在的，通常是反應態中原子鍵合環境與過渡態中發現的鍵合環境差異的結果。
確定酶活性的能力對臨床化學極其重要，因為它可以早期診斷各種疾病，並幫助醫生確定治療這些疾病的方案。當酶和底物結合形成 ES 複合物時，它們的光譜特性會發生變化。為了測量酶表現出的這種活性，使用以下光譜技術：熒光光譜、紫外/可見光譜、分光光度法測定和紅外光譜。
熒光光譜
熒光光譜揭示了 ES 複合物的存在及其組成。在熒光光譜中，化合物暴露於紫外光，這會激發某些分子並導致它們以較低的波長髮射光，這通常是在可見光範圍內。這種現象，即分子在一種波長下吸收光子導致同一分子在較長波長下發射另一個光子的現象，稱為熒光。在這種光譜技術中，測量底物的熒光並將其與產物的熒光進行比較，在兩種測量的差異中測量酶活性。
光消光測量的典型過程如下。在預定的時間間隔內，透過測量酶樣品的光消光來收集 5-7 個測量點，其中在反應過程中消耗或產生光吸收物質。這可以使用光度計測量。然後找到這些測量點的平均值和標準差，並相對於時間作圖。然後透過這些點繪製迴歸曲線。然後可以從特定時間點回歸曲線的斜率找到酶活性。
許多熒光化合物中發現的雜質在暴露於光線下時會干擾光譜，使這種技術比其他測定法更敏感。
紫外-可見光譜
與熒光光譜互補的一種方法是紫外-可見光譜，因為熒光光譜處理從激發態到基態的躍遷，而紫外-可見光譜處理從基態到激發態的躍遷。紫外光譜使用紫外區域的光，在該區域分子最有可能發生電子躍遷。所謂電子躍遷是指當分子吸收紫外能量時，這會導致電子變得激發，這意味著它們迅速且不穩定地移動到更高的能級軌道。紫外光譜中使用的儀器是紫外/可見光分光光度計。該裝置測量光透過樣品的透射率。用於計算透射率的公式為 A=-log(%T)，其中 A 為吸光度，T 為 I/Io，其中 I 為透過樣品的光強度，Io 為初始光強度，在它透射透過樣品之前。一旦計算出吸光度，就可以將其相對於波長作圖，得到紫外/可見光譜。
分光光度法測定
分光光度法測定可以透過測量測定吸收多少光來跟蹤反應過程。當光在可見光區域 (400-750nm) 被吸收時，測定將實際上改變顏色。這被稱為比色測定。比色測定的一個例子是 MTT。在 MTT 測定中，黃色 MTT(3-(4.5-二甲基噻唑-2-基)-2.5-二苯基四唑溴化物) 在細胞線粒體中還原為紫色甲臢，使反應呈現紫色，這可以進行酶的分析。使用某種溶液來溶解紫色的甲臢產物。然後使用分光光度計測量波長，通常在 500-600nm 之間。使用的溶劑決定了最大吸收波長。
紫外-可見光譜
紫外-可見光譜是一種常用的分光光度法測定，它檢查紫外-可見光區域的光子。它主要用於確定特定溶液中高度共軛有機化合物或酶的含量。比爾-朗伯定律用於紫外-可見光譜來確定吸收光的物質的濃度。比爾-朗伯定律指出
A=-log10(I/I0)
該方程式顯示了溶液濃度與溶液吸收之間直接成正比的關係，其中 A 是溶液的吸收，I 指的是它的濃度。
紅外光譜
另一種可用於獲取有關酶-底物複合物資訊的光譜是紅外光譜。在酶-底物複合物中，存在組織良好的結合模式，這可以使用紅外方法進行量化。在分析紅外資料時，可以識別 ES 複合物的結合模式和異質性。
需要探測器來實際測量在前面描述的過程中產生的酶活性。以下描述了行業中使用的典型探測器。
紫外/可見光探測器
紫外/可見光探測器是工業中最常用的探測器，因為它們用途廣泛，具有很寬的動態範圍，靈敏度高，並且不受溫度和流量變化的影響。
固定波長探測器
固定波長探測器使用在特定波長下發射光的燈。為了選擇特定波長，可以使用截止濾光片。固定波長探測器很好，因為它們不會產生很多噪聲，執行成本不高，而且執行相對簡單。
可變波長探測器
可變波長探測器與固定波長探測器不同，因為它們使用一系列波長，通常在 190-700 nm 之間連續，而不是一次只使用一個波長。對於可變波長探測器中的波長選擇，使用連續可調單色儀。燈通常是氘燈或鎢燈。來自燈的光線傳播到鏡子，鏡子聚焦和引導光線進入衍射光柵，光柵驅動機構都是單色儀元件的一部分。為了監測不止一個波長，光柵在兩個不同波長之間快速調整。
可變波長探測器的最新發展之一是二極體陣列探測器 (DAD)。DAD 透過將多個探測器並排放置在矽晶體上並使用電容器將光轉換為電荷來加速整個過程。這使得來自光柵的光可以比傳統分光光度計更快地被檢測到。使用 DAD 相比於電機驅動單色儀的優勢在於它們擁有更少的移動部件，並且在高速率下不太可能出現不規則資料。
熒光探測器
熒光檢測器僅在化合物無法透過其他方法檢測到且化合物必須具有熒光或可以透過與熒光化合物反應而具有熒光時使用。發射的光強度與激發輻射的功率成正比，因此熒光檢測比吸收檢測靈敏得多。通常，熒光檢測器由光源、波長反射器和單流或雙流池組成。
光源通常為氙燈、汞燈或石英鹵素燈。波長反射器允許獲取化合物的激發光譜。該資訊可用於快速最佳化方法和驗證分離質量。最後，單流和雙流池分別考慮流動相的熒光。
折射率 (RI) 檢測器
折射率 (RI) 檢測器測量參考池和樣品池中折射率的變化。該方法的缺點是化合物之間的折射率可能非常小，因此 RI 檢測器的靈敏度遠小於紫外/可見光和熒光檢測器。使用 RI 檢測器的另一個缺點是檢測器響應受流動相組成的影響，這意味著最終收集的資料存在很多誤差。RI 檢測器有三種類型：偏轉式、菲涅耳式和干涉式，但偏轉式是最常用的。
在偏轉式檢測器中，光束穿過玻璃稜鏡中的兩個平行腔室，其中一個作為參考。如果溶液的折射率等於參考的折射率，則光束平行於入射光束。但是，如果折射率不同，則光束會偏轉，然後由差分光電二極體測量。
電化學檢測器
電化學檢測器最常用於生物胺，因為它們比以前的方法更靈敏、更具選擇性。電化學檢測器有兩種型別：整體性質和溶質性質。整體性質檢測器最常用，它們測量電池電阻的變化。溶質性質檢測器監測溶質透過電池時電勢或電流的變化。溶質透過電極，電極保持恆定電壓。產生的電流與溶質濃度成正比。
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