結構生物化學/蛋白質/蛋白質序列測定技術

目的

蛋白質的氨基酸序列是瞭解其功能、結構和歷史的寶貴來源。 1. 可以將蛋白質的序列與其他已知序列進行比較，以確定是否存在重大相似性。使用計算機，搜尋新測序蛋白質與數百萬個先前測序蛋白質之間的親緣關係只需幾秒鐘。如果新分離的蛋白質屬於已知的蛋白質類別，我們可以推斷有關該蛋白質結構和功能的資訊。 2. 不同物種之間同一蛋白質序列的比較揭示了進化途徑。基於蛋白質序列之間的差異，可以推斷出物種之間的系譜關係。假設蛋白質的突變率是恆定的，分析不同物種不同蛋白質的序列可以提供資訊，說明這兩個進化譜系何時分化。例如，比較靈長類動物中發現的血清白蛋白表明，人類和非洲類人猿在 500 萬年前而不是 3000 萬年前分化。 3. 可以搜尋氨基酸序列中是否存在內部重複。這種重複揭示了蛋白質的歷史，許多蛋白質源於原始基因的重複，然後是多樣化。 4. 許多蛋白質包含充當其目的地訊號或控制其過程的氨基酸序列。 5. 序列為製備針對目標蛋白質的特異性抗體提供了基礎。氨基酸序列的一部分在注射到小鼠或兔子體內時會引發抗體。這些特異性抗體可用於確定血液中蛋白質的含量。 6. 氨基酸序列對於製作用於編碼其蛋白質的 DNA 探針很有價值。通過了解一級結構，它允許使用反向遺傳學。可以根據遺傳密碼構建對應於氨基酸序列部分的 DNA 序列。這些 DNA 序列可用作探針來分離編碼該蛋白質的基因，以便可以確定整個序列。該基因反過來可以提供有關該蛋白質的生理調節的資訊。

確定氨基酸序列

1. 水解
將肽在 110 ^o C 的 6M 鹽酸 (HCl) 中加熱 24 小時。此過程是將肽鏈水解成其氨基酸所必需的。

2. 分離
透過在磺化聚苯乙烯上的離子交換色譜柱上用 pH 升高的緩衝液洗脫混合物，識別來自肽的氨基酸。使用的緩衝液體積可以與特定型別的氨基酸相關聯。側鏈最酸性的氨基酸將首先出現，而側鏈最鹼性的氨基酸將最後出現。每種氨基酸的量（一種、兩種或三種相同型別的殘基）可以透過吸光度來確定。

3. 定量
透過使肽中的氨基酸與茚三酮反應來量化它們，茚三酮用於檢測微克的氨基酸。大多數氨基酸會呈現出強烈的藍色，而脯氨酸由於其結構中的仲胺基而呈現出黃色。此外，為了檢測納克的氨基酸，可以使用與α-氨基反應的菼光胺，產生高度菼光的產物。氨基酸的濃度與用茚三酮處理的樣品的吸光度或用菼光胺處理的樣品的菼光發射成正比。

這種方法只告訴你蛋白質的組成，而不是氨基酸的順序。埃德曼降解是提供蛋白質中氨基酸序列順序的方法。

然後在確定氨基酸組成後，確定氨基酸序列。它可以使用兩種互補的方法完成

1.埃德曼降解

該方法透過逐個從氨基末端裂解氨基酸來完成。用於此過程的化學物質是苯異硫氰酸酯。與這種化學物質反應的氨基酸將形成苯硫代氨基丹醯 (PTH)-氨基酸（例如 PTH-甘氨酸）。在弱酸性條件下，(PHT)-一個末端殘基被釋放。然後使用色譜方法識別這種化合物。埃德曼降解執行起來相當簡單（測序儀是自動化的），但這種方法對長肽（超過 50 個殘基）無效，因為它執行一個降解迴圈需要一個小時。

色譜方法的一個例子是高效液相色譜。在此過程中，PTH-氨基酸被分離成其組分，以便可以透過其吸光度和洗脫時間找到氨基酸的特性。

埃德曼降解是在不破壞殘基之間鍵的情況下對蛋白質進行測序的最有效的技術。此外，自動化測序儀的開發使得多肽測序更快、更高效。

使用各種化學物質和酶進行控制切割

有關特殊酶和化學物質的清單，請參見[1]

已知某些化學物質和酶會在特定位置切割肽（例如：某些氨基酸的氨基或羧基端）。使用這些化學物質和酶，可以將肽切割成可以透過埃德曼降解分析的片段。透過組合兩種或多種在不同位置切割肽的化學物質和酶，得到的較小片段（其氨基酸序列已透過埃德曼降解確定）可以像拼拼圖一樣組合在一起。

埃德曼降解的侷限性

即使長度小於 50 個氨基酸的肽，在進行埃德曼降解時也可能出現問題。這種情況的一個例子是當氨基酸的 N 末端處於不利的位點時，例如蛋白質的內部，或者當它被隔離時。此外，埃德曼降解可能會由於蛋白質的翻譯後修飾而失敗，例如糖基化、乙醯化、磷酸化和脂肪酸新增。例如，氨基酸的甲醯化將阻止與苯異硫氰酸酯的反應。特別是，兩個半胱氨酸 (Cys) 之間的二硫鍵可能會透過隔離 N 末端或空間阻礙苯硫脲中間體的環化來使測序複雜化。這可以透過還原二硫鍵（用 β-巰基乙醇或 DDT）和用甲酸氧化半胱氨酸側鏈至其相應的磺酸來進行修飾，以防止二硫鍵的形成，然後像往常一樣執行序列。

2. 質譜法

質譜法是另一種可用於確定蛋白質序列的技術，但它只能透過特定酶裂解的片段識別母體蛋白質。透過測量這些離子被雷射束觸發並穿過飛行管到達檢測器時的飛行時間，可以獲得電離蛋白質的質量。由於牛頓第二定律 (F = ma)，質量較輕的離子將移動得更快，並首先到達檢測器。然後分析記錄的質譜圖，並與已測序蛋白質的資料庫進行比較。因此，如果用不同的酶重複該過程，可以詳細確定蛋白質片段的序列；片段變得更小，因此可以將重疊片段用於確定順序。

質譜法的侷限性

使用質譜法來確定蛋白質序列的一個侷限性是在多種氨基酸具有特定質量的情況下。例如，由於亮氨酸和異亮氨酸具有相同的分子量 (131.17 g/mol)，因此對於這兩種氨基酸會獲得相同的質譜資料，在這種情況下，這種方法無效。

參考文獻

Berg, Jeremy M. 生物化學。第 7 版。 (79-80)