結構生物化學/蛋白質/蛋白質印跡
蛋白質印跡是另一種利用抗體來檢測樣本中特定蛋白質的存在的技術。它能夠檢測細胞或體液中少量的蛋白質。蛋白質印跡能夠從混合物中找到蛋白質。
蛋白質印跡起源於斯坦福大學喬治·斯塔克的實驗室，是一種透過特定抗體染色來檢測特定蛋白質的技術。它的分析可以告訴我們蛋白質的大小或細胞中積累了多少蛋白質。但這並不意味著它可以用於任何蛋白質，因為如果蛋白質快速降解，就很難檢測到它。這項技術中重要的是抗體，因為蛋白質印跡基於使用“高質量”抗體作為探針來檢測特定蛋白質。在這個技術中，我們首先使用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳來分離蛋白質，該電泳基於蛋白質的大小。然後，將凝膠上的這些蛋白質透過印跡轉移到聚合物片材的表面。一旦我們將針對所需蛋白質的特異性抗體新增到片材中，它就會與該蛋白質結合，因為它們沒有其他東西可以結合。然後，我們將未結合的一抗洗掉，這種蛋白質-一抗可以透過二抗檢測。這些二抗只能識別一抗，其中許多二抗與一個一抗結合併發出訊號，即二抗上的放射性標記在X射線片上產生一條深色條帶。
- 樣品進行SDS PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳），其中SDS去汙劑附著在蛋白質上，使其相對於大小帶負電荷，從而使蛋白質遷移到帶正電荷的陰極。較大的蛋白質透過丙烯醯胺凝膠基質移動速度較慢，而較小的蛋白質移動速度較快，從而形成基於基質中遷移速度和隨後大小的不同梯度條帶。
- 產生的蛋白質條帶被轉移到與蛋白質結合的聚合物片材（硝酸纖維素濾膜或聚偏氟乙烯，PVDF）上。這使得蛋白質能夠與抗體結合。
- 由於聚合物片材結合所有蛋白質，因此片材上剩餘的空白空間必須被封閉，以防止它與抗體反應。這是透過將聚合物片材在脫脂奶粉中洗滌來完成的，脫脂奶粉含有酪蛋白（一種蛋白質），這將覆蓋片材的其餘部分。
- 然後將片材與針對目標蛋白質的一抗孵育。在洗滌和稀釋後，將片材再次與二抗孵育，二抗與一抗結合。通常，這種二抗是熒光或放射性標記的。將片材再次洗滌並稀釋。
- 將片材與酶底物孵育，該底物將使二抗發出光。照相底片將檢測到這種光，顯示為深色條帶。放射性標記的抗體透過X射線片檢測。
影響轉移的因素
緩衝液
一種常用的轉移緩衝液是Tris-甘氨酸，其pH值為8.3，含有低濃度的SDS和20%甲醇。甘氨酸代替Cl，因為它具有較低的電荷密度，而電流越低，產生的熱量就越少。在這個pH值下，許多蛋白質將帶輕微的負電荷，這將使蛋白質更容易轉移，因為它們將傾向於向帶正電荷的電極移動。SDS有利於從凝膠中洗脫，因為它覆蓋了帶負電荷的蛋白質。但是，如果蛋白質帶的負電荷過多，疏水性膜將排斥蛋白質，因此蛋白質不太可能轉移到膜上。為了防止這種情況，將使用甲醇從蛋白質中去除SDS，SDS覆蓋了蛋白質上的疏水位點，然後這些疏水位點可以與膜結合。如果沒有甲醇，則有利於從凝膠中洗脫，但膜上的結合效果不佳。如果甲醇過多，則在蛋白質離開凝膠之前SDS可能會全部脫落，而暴露的疏水區域可能會聚集形成大型蛋白質聚集體，這些聚集體將被困在凝膠中，因此無法轉移出來。
膜
有不同型別具有不同孔徑的膜。最常用的膜的孔徑約為0.45微米，但對於有效捕獲尺寸小於20kDa的蛋白質，需要更小的孔徑。
轉移過程中的電壓
電流比電壓更重要。這裡的一個因素是加熱。第二個因素是，如果電流過高，低分子量蛋白質會很快穿過膜，以至於它們沒有機會與膜結合。
轉移時間
蛋白質的遷移將取決於其大小。蛋白質尺寸越大，遷移所需的時間越長。有時，會在凝膠旁邊放置兩層膜，以捕獲可能穿過第一層膜的較小蛋白質。
蛋白質電荷
如果蛋白質在去除SDS後帶正電荷，那麼它們將難以轉移。因為它們的等電點可能與緩衝液體系的pH值相似。因此，蛋白質不會向正極遷移，也不會轉移到膜上。我們可以透過將緩衝液體系的pH值提高到更高的值來解決這個問題。
•蛋白質印跡是一種有效且有用的方法，可以檢測和表徵少量的蛋白質，例如時鐘蛋白。此外，還可以使用蛋白質印跡來查詢時鐘蛋白的其他特性，如半衰期、摩爾量。
•這項技術可以很容易地檢測到來自感染性病原體（例如病毒、細菌）的免疫反應。
•蛋白質印跡不僅利用抗原，還利用抗血清作為診斷工具。抗血清廣泛用於檢測HIV的存在。
•與ELISA相比，蛋白質印跡具有更高的特異性；特異性越高，方法對抗體特異性的依賴性就越小。
•聚偏氟乙烯（PVDF）或尼龍通常用作蛋白質印跡中的膜，因為它具有高蛋白質結合能力和化學穩定性。甚至，一些蛋白質組只與尼龍結合或強烈地偏向於尼龍。
•在三種常見的酶底物中，熒光和化學發光產生可透過X射線或掃描器檢測到的光。這種能力使高靈敏度和更快的處理時間成為可能。
•非目標蛋白質有輕微的機率與二抗反應，導致錯誤蛋白質的標記。
•蛋白質的意外磷酸化或氧化可能會導致樣品處理後出現多個條帶。
•當將樣品從凝膠/膜夾層中轉移時，可能會出現氣泡，也可能在用抗體孵育樣品時出現氣泡，從而導致條帶讀數出現偏差。
•如果將蛋白質轉移到膜上的轉移時間不夠，則分子量較大的蛋白質將無法正確轉移，導致錯誤的條帶讀數或根本沒有條帶讀數。
•轉移緩衝液中的甲醇過多會降低蛋白質從凝膠轉移到膜的效率；但是甲醇有助於蛋白質與幾種不同的膜結合，因此需要正確的平衡。
•蛋白質印跡是一個非常微妙的過程，需要每個組分的正確量才能成功識別蛋白質的存在。程式中任何步驟的不平衡都可能使整個過程出現偏差。
遠端蛋白質印跡基於蛋白質印跡技術。主要區別在於遠端蛋白質印跡使用非抗體蛋白質，這些蛋白質可以與目標蛋白質結合。遠端蛋白質印跡用於檢測蛋白質-蛋白質相互作用。
東方印跡法是西方印跡法的擴充套件，用於檢測蛋白質翻譯後修飾。東方印跡法用於檢測脂醯化、糖基化或磷酸化蛋白質，或其他翻譯後修飾的蛋白質。印跡主要是在 SDS-PAGE 凝膠上進行，然後轉移到 PVDF 或硝酸纖維素膜上。透過特異性探針檢測翻譯後蛋白質修飾，包括磷酸化、脂醯化、糖基化或任何其他蛋白質修飾。
分析由高效薄層色譜 (HPTLC) 分離的條帶。進一步的分析是透過將 HPTLC 板轉移到 PVDF 膜上，然後進行酶或配體測定或質譜分析來進行。該方法的缺點是，由於色譜和西方印跡都需要單獨進行後實驗讀取，因此在連續準備兩者時存在較長的停機時間。
遠東印跡法允許以下技術：■ 糖鞘脂和磷脂的純化。■ 與直接質譜聯用的脂質結構分析。■ 使用各種配體（如抗體、凝集素、細菌、病毒和毒素）進行結合研究，以及 ■ 膜上的酶反應。
• 此外，重要的是要知道，在大多數情況下，印跡是硝酸纖維素或聚偏氟乙烯膜，當浸入凝膠並施加電流時，它是可移動的。為了使蛋白質沿著凝膠移動，蛋白質必須是可溶的。需要裂解緩衝液來完成此操作。（參考：www.abscam.com/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf）。
• 西方印跡法用於人類免疫缺陷病毒 (HIV) 檢測。印跡用於檢測人血樣中的抗 HIV 抗體。被 HIV 感染的細胞的蛋白質被分離並在膜上印跡。然後將人血樣用於抗體孵育步驟，並將遊離抗體洗去，然後加入第二抗人抗體。在 X 射線分析後，染色條帶顯示該人血液中包含抗體的蛋白質。
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