結構生物化學/p73
p73 是 p53 家族的 轉錄 因子的一部分，該家族還包括 p63。該家族以其調節細胞週期停滯和 凋亡 的能力而聞名。p73 和 p63 在結構和功能上都與 p53 相似，據信它們也是 腫瘤抑制蛋白[1]。p73 的單體與 p53 有 50% 的同源性，導致兩種蛋白的摺疊非常相似。[2] 儘管這兩種蛋白具有非常相似的結構和功能，但 50% 的癌症具有突變的 p53 蛋白，而只有 0.5% 的癌症具有突變的 p73 蛋白，這對科學家來說非常有趣。[2]
p73 蛋白具有與 p53 非常相似的 DNA 結構域結構。p73 蛋白比 p53 蛋白更大，因為它具有 636 個氨基酸序列。[2] 與 p53 相似，它有三個結構域，包括一個轉錄啟用域 (TA)，該域是 p73 N 末端之後的富含脯氨酸的序列，一箇中央 DNA 結合域 (DBD) 和一個具有寡聚化域 (OD) 的 C 末端。[3] 由於它們屬於同一個蛋白家族，p73 與 p53 共享 50% 的序列同源性，尤其是在 DBD 中。[2] 序列的相似性導致了相似的摺疊結構，這使得 p73 能夠以與 p53 非常相似的方式發揮作用，例如識別和調節 p53 蛋白的靶標。[2] 然而，寡聚化域在這兩種蛋白之間不太保守。在該區域，p73 與 p63 更相似，因為它可以與 p63 異寡聚化，但不能與 p53 異寡聚化。[1]
p73 存在多種亞型。有一些亞型擁有與 p53 上的位點相似的轉錄啟用位點，並用 TAp73 表示。其他亞型是 ΔNp73，這些亞型最初來自 TAp73 啟動子轉錄，由於異常剪接而不具有 N 端轉錄啟用域。[4] 研究表明，小鼠 TAp73 的敲除使小鼠更容易受到致癌物質的影響，因此更容易發生腫瘤。然而，體內敲除 ΔNp73 實際上減少了腫瘤生長，表明基因的兩種不同亞型會導致不同的結果。[4]
p53 家族蛋白在不同的途徑中發揮作用，但它們確實有一些重疊的功能。[2]
- MDM2 降解 p53 和 p73。
- p53 和 p73 都在觸發凋亡中發揮作用
然而，研究表明，只有 p53 被敲除的細胞與 p53 和 p73 都被敲除的細胞具有不同的化療敏感性。[5] 在化療中，患者會接受靶向快速生長的細胞並殺死它們的藥物。癌細胞繁殖速度非常快，因此更容易成為這些藥物的靶標，但是其他快速生長的細胞，如頭髮和胃壁，也可能是這些藥物的靶標。在一些體內和體外研究中，已經觀察到，突變的 p53 實際上能夠與 p73 結合並使該蛋白失活，導致細胞對化療更具耐受性。[5]
TAp73 可以在 G1 和 G2 期停止細胞週期。在 G1 期，TAp73 透過 p21 和 p57/Kip2 的轉錄上調來阻止細胞週期，p21 和 p57/Kip2 是阻止細胞週期繼續的蛋白質。[3] 在 G2 期，p73 抑制 G2/M 調節劑，包括 CDC25B、CDC25C、Cyclin B1、Cyclin B2、cdc 2 和 Topoisimerase IIα，從而阻止細胞離開間期並進入 有絲分裂。[3] 即使在有絲分裂中，當 p73 被推測為高度磷酸化且非常不活躍時，它仍然發揮作用，因為它可以轉錄 p57/Kip2 基因，這些基因是細胞增殖的負調節因子。[3] 已經證明，TAp73 與紡錘體組裝檢查點相互作用，並有助於該活動，並且據信該點處的故障是腫瘤發生的原因。[3][4]
TAp73 還可以透過多種機制發出細胞死亡訊號。透過線粒體途徑，TAp73 能夠上調 Bax 並促進其移動到 線粒體，這發生在 Bax 接受凋亡訊號時。[3] 透過內質網應激途徑，p73 上調 scrotin，scrotin 是一種可以在 ER 以及超基底角質形成細胞中誘導凋亡的基因。[3]。它還可以調節死亡受體途徑並誘導 CD95 表達（一種死亡受體）。[3]
這種 p73 的亞型被認為是 TAp73 和 p53 的負調節因子，因為它抑制了生長抑制和細胞凋亡。ΔNp73 透過形成無活性的寡聚體來抑制 TAp73 的轉錄活性，並與 p53 競爭 DNA 結合位點。[3] 研究表明，在癌症細胞中，ΔNp73 的減少會導致細胞凋亡。[4] 然而，當 TAp73 和 p53 被啟用時，會發生一個反饋環路途徑，該途徑會誘導 ΔNp73，形成一個自調節反饋環路，從而保證不會有太多活性的 TAp73 和 p53 分子。研究還表明，如果檢測到 DNA 損傷，就會觸發 ΔNp73 的降解，從而使 TAp73 能夠發揮作用。[3]
增加 TAp73 數量和減少 ΔNp73 數量的一種可能方法是控制 TAp73 啟動子轉錄本的剪接。在肝細胞癌細胞中，導致轉錄本從 TAp73 轉變為 ΔNp73 的異常剪接是由剪接因子 Slu7 的耗竭引起的。Slu7 的耗竭是由 c-Jun N 末端激酶 1 (JNK-1) 活性引起的，而 JNK-1 活性又是由 AR 啟用 EGFR 引起的。[4] 另一種增加 TAp73/ΔNp73 比例以有利於 TAp73 的方法是使用 COX-2 抑制劑塞來昔布，研究表明塞來昔布可以增加神經母細胞瘤細胞中的 TAp73β。[4]
p73 的調控
[edit | edit source]在大多數實體瘤中，實際上 p73 的含量豐富，但它無法發揮任何抗腫瘤活性，因為它被各種抑制劑所阻斷，這些抑制劑包括家族蛋白（如 ΔNp73、ΔNp63、突變的 p53）和非家族蛋白（如 MDM2、iASPP 或 mTOR）。[4] 由於 p73 的功能眾多且複雜，因此在它被轉錄後，透過改變蛋白質的穩定性或位置以及蛋白質與啟動子結合的能力來對其進行調控。p73 透過泛素化系統降解來進行調控。[3] MDM2 負責降解 p53 蛋白，它也可以與 p73 結合。然而，它不會降解蛋白質，而是將其轉移到核斑點並改變其轉錄活性。E3 泛素連線酶 ITCH 與 p73 結合，在正常情況下促進蛋白質降解。在壓力情況下，ITCH 被下調，p73 和 p63 的水平會升高。與 MDM2 不同，ITCH 只針對 p63 和 p73。[3] 其他可以調節 p73 的基因包括：PIAS1，它使 p73 發生 SUMO 化，從而降低 p73 的轉錄活性，並使細胞退出細胞週期的 G1 期。當 Cyclyn/CDK 複合物對 p73 進行蘇氨酸磷酸化時，p73 的轉錄活性也會降低。SIRT1 抑制 p73 的乙醯化，從而降低 p73 的活性。[3]
實驗
[edit | edit source]調控 DNA 損傷修復 [6]
[edit | edit source]當正常細胞暴露於膽汁酸時，p73 的作用在應對 DNA 損傷時被啟用。膽汁酸暴露導致的 DNA 損傷增加僅觸發了 p73 的反應；這一結果表明 p73 的誘導獨立於 p53 和 p63，但依賴於 c-Abl 激酶的選擇性啟用。p73 的誘導激活了兩種糖基化酶 SMUG1 和 MUTYH 的轉錄，以進行鹼基切除修復。當 p73 缺乏時，會明顯出現 DNA 損傷增加[6]。
食管腺癌的發生涉及胃食管反流病的嚴重進展，胃液與膽汁酸混合並進入食管。食管暴露於胃酸和膽汁酸會導致炎症和組織損傷。此外，膽汁和酸的反流會導致基因毒性壓力，這會增加 ROS 和 RNS 的產生，並最終導致 DNA 氧化損傷。
方法[6]。
[edit | edit source]細胞培養、轉染、逆轉錄病毒感染和 BA 處理
在 DMEM 中培養初級胎兒食管成纖維細胞、人非腫瘤性食管上皮細胞系和 p53 缺失的食管腺癌細胞系。在含有牛垂體提取物和表皮生長因子的 KSFM 培養基中培養 hTERT 永生化的食管上皮 EPC2 細胞。然後使用帶有 shRNA 的慢病毒轉導或 RNA 轉染來抑制 P73，這兩種方法都針對所有亞型中發現的特異性序列。
抗體、免疫沉澱和免疫熒光
抗體用於以下各種蛋白質：p73、p63、c-Abl、磷酸化 c-Abl、磷酸化 p53、β-肌動蛋白、磷酸化組蛋白 H2A.X、磷酸化酪氨酸、8-氧鳥嘌呤、p53、p21、PUMA、SMUG1、MUTYH 和非特異性兔 IgG。使用抗 p73 抗體進行免疫沉澱，並使用蛋白質印跡法分析 p73 的酪氨酸磷酸化。進行免疫熒光時，將細胞在腔室側培養至 50% 匯合。對磷酸化組蛋白和 8-氧鳥嘌呤進行染色，並測量熒光訊號的強度。
即時 PCR 和染色質免疫沉澱
分離 RNA，使用高容量 cDNA 逆轉錄試劑盒逆轉錄總 RNA，並使用即時 PCR。對 p73 抗體進行染色質免疫沉澱，非特異性兔 IgG 用作 HET-1A 細胞的陰性對照。然後分析 p73 結合位點。使用特定序列的引物來分析 p73、MUTYH、SMUG1 mRNA 水平和 ChIP。
PCR 陣列、彗星和磨損部位量化分析
彗星分析是根據協議進行修改的。將細胞與低熔點瓊脂糖混合並塗抹到預塗有瓊脂糖的載玻片上。使用緩衝液誘導細胞裂解，然後在鹼性條件下進行電泳。然後對載玻片進行染色，使用 CometScore 軟體進行分析。比較和分析了 p73 缺陷和 HET-1A 細胞中的 mRNA 表達。
手術程式和免疫組織化學
分析了攜帶野生型 p73 和正常 p73 基因的小鼠品系。對攜帶野生型 p73 和正常 p73 基因的小鼠進行食管空腸吻合術。處死 15 周齡的小鼠，取下下食管，透過免疫組織化學進行分析。
結果[6]
[edit | edit source]用 BA 混合物處理非腫瘤性食管 HET-1A 細胞，並使用磷酸化 H2A.X 和 8-氧鳥嘌呤抗體透過免疫熒光分析 DNA 損傷。少量暴露於 BA 混合物會透過氧化和鏈斷裂造成 DNA 損傷。然後分析了 BA/A 處理後 p53 家族的存在。儘管存在 DNA 損傷，但 p53 在絲氨酸 15 的磷酸化沒有增加，從而誘導 p53 啟用。只有當 HET-1A 細胞用稱為順鉑的 DNA 損傷藥物處理時，才會出現 p53。BA/A 處理後，p53 水平下降，並在長時間後無法檢測到。BA/A 處理 SKGT-4 細胞會導致 p73 上調和啟用；分析表明，p73 的誘導獨立於 p53。由於上皮細胞中 p73 的 mRNA 水平沒有增加，因此表明上調發生在翻譯後階段。c-Abl 蛋白激酶的存在誘導酪氨酸磷酸化，進而啟用 p73 蛋白。
透過抑制 p73 蛋白，明顯的氧化性 DNA 損傷會增加。P73 透過直接與這兩種糖基化酶結合並調節其轉錄來啟用參與鹼基切除修復的 SMUG1 和 MUTYH。因此，p73 蛋白的下調會降低 SMUG1 和 MUTYH 的兩種糖基化酶[6]。
參考文獻
[edit | edit source]- ↑ a b Andrea Bisso、Licio Collavin 和 Giannino Del“p73 作為癌症治療的藥物靶點”義大利特里斯特科學園區帕德里奇亞諾 99 號國家 CIB 實驗室。義大利特里斯特大學生命科學系，Via L. Giorgieri 1 號，34100，特里斯特。
- ↑ a b c d e f Viadiu，Hector。“P53 蛋白家族的基因識別。”CHEM 114A 講座。加州大學聖地亞哥分校，拉荷亞。2012 年 11 月 14 日。講座。
- ↑ a b c d e f g h i j k l m N. Allocati，C. Di Ilio，V. De Laurenzi，細胞週期和細胞死亡控制中的p63/p73，實驗細胞研究，第 318 卷，第 11 期，2012 年 7 月 1 日，第 1285-1290 頁，ISSN 0014-4827，10.1016/j.yexcr.2012.01.023。（http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014482712000444)
- ↑ a b c d e f g Maas，Anna-Maria，Anne Catherine Bretz，Elisabeth Mack 和 Thorsten Stiewe。“靶向癌症中的 P73。”癌症快報 (2011): n. pag。網路。
- ↑ a b Irwin，Meredith S.“化療敏感性中的家族爭端。”細胞週期 3.3 (2004): 319-23。PubMed.gov。網路。2012 年 11 月 14 日。<http://www.landesbioscience.com/journals/cc/irwinCC3-3.pdf.
- ↑ a b c d e Zaika，Elena，Jinxiong Wei，Dengping Yin，Claudia Andl，Ute Moll，El-Rifai 和 Alexander Zaika。“p73 蛋白調節 DNA 損傷修復。”FASEB 雜誌。25。(2011): 1-9. 列印。