結構生物化學/DNA重組技術/Southern印跡
Southern印跡，以其發明者埃德溫·薩瑟恩命名，是一種在分子生物學中常用的技術，用於分離和表徵DNA。透過以下步驟，它可以有效地識別特定的DNA模式。Southern印跡是一種技術，用於透過瓊脂糖凝膠電泳來確定混合物中是否存在特定的DNA序列。
Southern印跡是一種雜交技術，使研究人員能夠確定DNA樣本中是否存在某些核苷酸序列。
Southern印跡是首創的此類技術。然而，不久之後，被稱為Western印跡和Northern印跡（以及其他技術）的類似技術就巧妙地以同名方式命名；密切遵循Southern印跡命名背後的慣例。這些技術不檢測DNA的存在，而是檢測蛋白質和RNA的存在，分別。
DNA用一種或多種限制性內切酶消化，然後根據大小透過瓊脂糖或丙烯醯胺凝膠電泳分離得到的片段。將DNA變性，並從凝膠轉移到固體支援物上。將DNA片段轉移到固體支援物（通常是硝酸纖維素板）上的原因是，DNA在嵌入凝膠中時無法被DNA探針接觸。在將DNA片段轉移到濾膜的過程中，它們的相對位置得以保留。然後，將附著在濾膜上的DNA片段暴露於一縷放射性標記的DNA，該DNA與板子上感興趣的DNA鏈互補。然後使用放射自顯影來定位與探針互補的條帶的位置。
1. 如果需要，DNA樣本用合適的限制性內切酶或限制性內切酶消化。然後，將消化產物透過瓊脂糖凝膠電泳分離。如果樣本中存在大量的限制性片段，樣本可能更像微弱的塗抹而不是離散的條帶。
- 凝膠電泳
到了1970年代，DNA片段是透過重力分離的。在那之後，科學家們發現了分離DNA片段的其他方法。那就是凝膠電泳。電泳利用電來分離不同大小的分子。
2. 然後對消化產物進行變性，以便轉移到膜上。由於樣本DNA是雙鏈的，只有單鏈DNA可以轉移，因此必須透過浸泡在合適的鹼性溶液（例如0.5M NaOH）中使樣本變性。如果樣本仍然太大而無法轉移（超過15kb），則可以透過用適當的酸處理樣本以脫嘌呤（例如，去除嘌呤）並將其分解成更小的片段。然後在繼續操作之前將樣本中和。
3. 將樣本轉移到膜上，該膜是用於分析的特殊吸墨紙。轉移到另一層膜上是為了在電泳結束後保留DNA片段的位置。通常使用硝酸纖維素膜，儘管有些人可能更喜歡使用尼龍膜，因為它具有更好的結合能力。還可以注意到尼龍比硝酸纖維素更耐用。將使用的膜放在凝膠頂部，通常在膜頂部放置紙巾以確保透過均勻施加壓力來均勻分佈。轉移通常透過毛細管作用完成，這可能需要幾個小時。或者，可以使用真空裝置；這與毛細管作用非常相似，但透過真空裝置轉移可能更快。轉移也可以透過電泳使DNA從凝膠中移出並轉移到膜上，這個過程稱為電轉移。
4. 然後用紫外線照射樣本，使樣本不可逆地共價交聯到膜上。或者，樣本可以在大約80°C下烘烤幾個小時（如果使用尼龍膜，只能這樣做，因為硝酸纖維素極易燃）。
5. 然後用標記的單鏈DNA（這是目標DNA序列）探測膜。此過程也稱為雜交。標記的DNA透過互補鏈的結合與膜DNA結合。標籤通常是32P探針標籤，但也可以使用生物發光探針或生物素/鏈黴親和素。雜交之所以重要，是因為它允許您實際看到它。需要注意的是，在雜交之前，應該進行預雜交過程以限制標記的DNA與特定位點的結合，否則標記的DNA可能會與樣本中不想要或不重要的位點結合。為此，使用經不同濃度的SSC、SDS和甲醯胺處理的鮭魚精子DNA。
- 32P標記
用限制量的DNase處理您作為探針使用的dsDNA片段，這會導致DNA中出現雙鏈缺口。在DNA聚合酶 I中新增32P、dATP和其他dNTP，該酶具有5'到3'聚合酶活性以及5'到3'外切核酸酶活性。
6. 分析結果。如果使用32P標記的探針，則將使用放射自顯影或使用X射線膠片來分析樣本，以揭示樣本中是否包含目標DNA序列。如果目標序列確實存在，X射線膠片將顯示出由32P放射性標記探針的β發射引起的黑色條帶。樣本中與目標序列非常相似的序列也將顯示出來。如果使用生物發光探針，則發光將是一種視覺化方法。如果使用生物素/鏈黴親和素，則透過比色法分析樣本，或透過觀察膜上顏色的顯現來分析樣本。
方法概述 : 首先，透過瓊脂糖凝膠電泳分離限制性片段混合物，變性形成單鏈DNA，然後轉移到硝酸纖維素薄片上。DNA片段在凝膠中的位置在硝酸纖維素薄片上得以保留，因為它直接從瓊脂糖凝膠上印跡到薄片上。接下來，將這些片段暴露於32P標記的單鏈DNA探針，該探針與具有互補序列的限制性片段雜交。雜交後，放射自顯影顯示限制性片段-探針雙鏈體的位點，最終顯示出DNA片段的身份。
Nisha Patel，UCSD兒科，Sander實驗室完成的Southern印跡照片上傳者：Patrick Phuong，UCSD，Sander實驗室
如上所述，Southern印跡法利用DNA探針來檢測互補的靶DNA序列的存在。在本例中，Southern印跡法使用來自小鼠群體的雄性小鼠的DNA進行。Southern印跡法是一種追蹤每一窩新小鼠的遺傳構成以及老小鼠基因型的有效方法。從圖中可以看出，雜合子、突變體和小鼠野生型都可以透過其印跡片段中出現的條帶型別來區分。雜合子小鼠同時擁有上下兩條帶的序列，而突變體小鼠只有下條帶。野生型小鼠只有探針檢測到的上條DNA。左側是DNA標準品，用於展示不同大小的DNA的遷移情況。頂部標籤顯示了小鼠系和生下這窩小鼠的母鼠編號，其DNA正在被印跡。
Southern印跡法的應用
[edit | edit source]透過使用這種技術，我們能夠在一個高度複雜的混合物中檢測單個特定的限制性片段，這些片段是由限制性內切酶切割整個人類基因組產生的。在如此複雜的混合物中，許多片段具有相同或幾乎相同的長度，因此在電泳過程中會一起遷移。
確定DNA樣本中是否存在特定序列的能力可以應用於多種用途。例如，Southern印跡法可以用於確定特定生物體基因組中特定基因的存在和數量，這也揭示了特定片段的分子量。由於該方法所涉及的步驟，特定限制性內切酶的限制性位點是否存在也可以被確定。它還可以用於比較探針序列與樣本之間的相似程度。
Southern印跡法還可以用於追蹤選定基因的遺傳。限制性位點內的突變會改變限制性片段的大小，因此，Southern印跡分析和放射自顯影中條帶的位置也會發生變化。這種位置變化之後可以與正常的印跡分析進行比較，以揭示可能發生變化的位置。由這些突變在人群中產生的遺傳多樣性，被稱為多型性。檢測到的突變反過來可能會產生不同的影響。它可能會導致疾病，也可能與導致疾病的基因密切相關。這類疾病的一些例子包括鐮狀細胞性貧血、囊性纖維化和亨廷頓舞蹈症。所有這些突變都可以透過比較限制性片段長度多型性與正常的DNA片段來檢測。
常見的誤解/區別
[edit | edit source]如前所述，Southern印跡法衍生出其他分析方法，如Western印跡法和Northern印跡法，分別對應於蛋白質和RNA的檢測。很多時候，這些技術的名稱會被錯誤地互換，更重要的是，人們會錯誤地認為它們使用相同的方法元件[例如儀器、化學物質等]。重要的是要認識到，雖然這些方法非常相似，但它們的不同之處在於每種技術都是針對特定的生物大分子；因此，它們的處理方法也不同。
舉個簡單的例子，考慮一下Southern印跡法與Northern印跡法的基本區別。雖然兩者都在最後一步使用放射自顯影來視覺化熒游標記，但它們的標記實際上是不同的。Southern印跡法使用32P標記的DNA探針與特定的DNA序列相互作用，而Western印跡法使用放射性標記的抗體與特定的蛋白質相互作用。其他例子包括用於轉移電泳後生物大分子不同的膜型別[Southern印跡法使用硝酸纖維素膜；Western印跡法使用聚合物膜]，甚至用於電泳本身的凝膠型別[Southern印跡法使用瓊脂糖凝膠；Western印跡法使用SDS凝膠]。為了避免混淆，Southern、Northern和Western印跡法也可以分別稱為：DNA、RNA或蛋白質印跡法。
參考文獻
[edit | edit source]Bartlett, Linda. "技術：重組DNA：Southern印跡法。" 圖片。visualsonline.cancer.gov 2001年1月1日。2009年10月14日。<http://visualsonline.cancer.gov/details.cfm?imageid=2016>
Berg, Jeremy M., Lubert Stryer和John L. Tymoczko。生物化學。第6版。波士頓：W. H. Freeman & Company，2006年。