結構生物化學/蛋白質/合成

合成長度超過 50 個氨基酸的肽的最常用方法是自動固相肽合成。R. Bruce Merrifield 最初開發了這種方法，它可用於DNA 和RNA。為了開始這個過程，所需序列的羧基末端氨基酸被錨定到聚苯乙烯珠上，肽從 C 末端到 N 末端反向合成（與從 N 末端到 C 末端的常規序列相反）。然後，透過用三氟乙酸 (CF3COOH) 和二氯甲烷 (CH2Cl2) 洗滌來去除該氨基酸的 t-Boc 保護基團，這不會破壞共價鍵。接下來，將具有 t-boc（二叔丁基二碳酸酯）、保護的 N 末端和 DCC（二環己基碳二亞胺）活化的 C 末端的下一個氨基酸新增到反應柱中。在形成肽鍵後，過量的試劑和二環己基脲用合適的溶劑洗掉。為了延長肽鏈，以相同的方式繼續新增下一個氨基酸。在合成結束時，透過新增氫氟酸 (HF) 從聚苯乙烯珠上釋放肽，HF 會裂解酯鍵而不會破壞肽鍵。此時，賴氨酸或組胺等反應性側鏈上的保護基團也會被去除。除了自動化之外，這種方法的巨大優勢在於純化步驟。由於雜質沒有與反應柱結合，因此可以在不損失合成產物的情況下將它們洗掉。在實驗室中，這種技術用於合成藥物，如胰島素。

過程

轉錄

它從細胞核開始。它與DNA 複製過程非常相似，在該過程中，DNA 被解旋酶“解開”，產生一條準備複製的核苷酸鏈。

轉錄 3 步總結 -> 從 DNA 生成 RNA 資訊

(A) 結合和起始

DNA 轉錄單位分為 TATA 盒和增強子區域。TBP 與 TATA 區域結合，其他轉錄因子（與該區域結合的蛋白質）如 TFIIA 和 TFIIB 也與 TATA 區域結合。除非先與轉錄因子結合，否則 RNA 聚合酶無法直接與 DNA 結合。當 RNA 聚合酶與增強子區域（或稱為起始位點）結合時，轉錄開始，透過需要 ATP 能量將其分成兩條鏈，起始啟動 DNA 鏈開始轉錄的位置。

(B) 延長

RNA 聚合酶透過執行兩步延長步驟沿著 DNA 啟動子區域移動

1) 它以 3.4 A 的速度解開（解開）雙螺旋 DNA 約 10 個鹼基。

2) 在不斷增長的 RNA 的 3' 末端新增核苷酸。

當 RNA 聚合酶移動時，不斷增長的 mRNA 分子被複製為鹼基對鹼基。轉錄大約每秒進行 60 個核苷酸。DNA 的核苷酸腺嘌呤將與 RNA 的尿嘧啶鹼基互補。DNA 的核苷酸鳥嘌呤將與胞嘧啶配對。

(C) 終止

轉錄在 RNA 聚合酶到達終止位點時進行。不再新增 RNA 核苷酸，並且釋放 mRNA。因此，mRNA 將從細胞核移到細胞質中，以便在蛋白質合成中進一步使用。

翻譯

該mRNA 密碼子翻譯成氨基酸多肽鏈，分為三個步驟。

翻譯的 3 步一般指導

起始 2. 小亞基核糖體附著到 mRNA 上。核糖體的大亞基與小亞基結合，A 位點（tRNA 的入口）和 P 位點（tRNA 的離開門）首先附著到一個 tRNA 上。反密碼子（tRNA 中的三聯體核苷酸）附著到 A 位點（入口位點）以與來自 mRNA 的 3 個核苷酸密碼子配對。tRNA 攜帶一個氨基酸。如下圖所示，tRNA。在頂部攜帶一個氨基酸

延伸 3. 啟動 tRNA。然後移動到 P 位點，A 位點開啟，以供第二個三聯體編碼的 tRNA 進入，以及另一個氨基酸。第二個 tRNA 結合到 A 位點後。然後透過肽鍵將氨基酸連線在一起。之後，第三個 tRNA 在第二個 tRNA 之後進入。移動到 P 位點。（從 3'' 到 5'' 移動） 4. 核糖體酶將氨基酸連線成一條鏈。這個過程將持續到遇到終止密碼子（UAA）為止。

終止

5. 遇到終止密碼子（UAA、UAG 或 UGA）。一種稱為釋放因子的蛋白質與 A 位點的終止密碼子結合。核糖體在多肽鏈的末端新增一個水分子。6. 核糖體解離成其組成部分

優勢

高產率和高純度。所有反應都在單個容器中進行，消除了因反覆轉移產品而造成的損失。該方法適用於合成長鏈肽（50 個殘基以上）。

合成肽

透過將一個氨基酸的氨基與另一個氨基酸的羧基連線可以合成肽；這是一種縮合反應的例子。縮合反應是兩個分子結合在一起，釋放水，形成一個分子的反應。

肽合成可以是特異性的；這意味著可以形成特異性/所需的產物。為了製造獨特的產物並防止副反應，使用保護基團，如叔丁氧羰基 (t-Boc)。T-Boc 用於簡單肽形成的第一步。為了阻斷 α-氨基，該保護基團與 α-氨基反應形成一個稱為叔丁氧羰基氨基酸的複合物。阻斷氨基之後，活化相同氨基酸的羧基。羧基被二環己基碳二亞胺 (DCC) 活化。

現在，對第一個氨基酸的氨基和羧基進行改變後，可以將第二個氨基酸連線到第一個氨基酸上。第二個氨基酸具有一個遊離氨基，這意味著沒有被阻斷，它與第一個氨基酸的活化羧基連線；形成堅固的肽鍵並釋放二環己基脲。新形成的二肽的羧基用 DCC 活化，並準備好與具有遊離氨基的第三個氨基酸反應。同樣，形成新的肽鍵並釋放二環己基脲。這個過程可以連續進行，直到合成所需的肽。為了結束合成，新增稀酸，它會去除 t-Boc 並使肽不受干擾。

固相法用於形成含有 50 個以上氨基酸的合成肽。它涉及將最後一個氨基酸的羧基結合到聚苯乙烯珠上。錨定氨基酸的 t-Boc 被去除，然後將具有 t-Boc 保護氨基和 DCC 活化羧基的下一個氨基酸新增到與聚苯乙烯珠結合的氨基酸中。肽鍵形成，用聚苯乙烯珠的肽被過濾和洗滌，因此肽在繼續合成之前是純的。以下氨基酸以相同的方式連線，直到合成所需的肽。最後，使用氫氟酸 (HF) 從珠子上去除完成的肽。

肽連線用於合成超過 100 個氨基酸的肽。長肽由兩個或多個沒有保護基團的小肽形成。天然硫醇連線是最強大、應用最廣泛的肽連線方法。長肽由 C 端羧基帶有硫酯基團的肽和 N 端帶有半胱氨酸的肽形成。一個肽的 C 端羧基上的硫酯基團與另一個肽的 N 端上的半胱氨酸反應形成硫酯連線的中間體。然後，中間體發生重排（S->N醯基轉移）形成肽鍵。透過這種過程將小尺寸的無保護肽連線起來，以合成長肽。

應用

合成肽用於多種目的。這些肽可以作為抗原，刺激機體的免疫系統產生針對該肽的抗體。然後，這些抗體可用於分離蛋白質。肽還可以分離激素受體。

合成肽還可以用作藥物。例如，加壓素的合成類似物，也稱為 1-脫氨-8-D-精氨酸加壓素。這種合成肽用於治療缺乏加壓素激素的尿崩症患者，該激素會導致他們從體內排洩過量的液體。透過使用加壓素類似物替代天然加壓素，可以治療這些患者。

File:Vasopressin.jpg

最後，合成肽可以用於更好地理解蛋白質的 3D 結構。使用合成蛋白質來研究蛋白質的 3D 結構非常有用，因為這些肽可以包含許多正常蛋白質中不存在的氨基酸；這意味著這些肽不侷限於 20 種標準氨基酸。這導致了更多樣化的結構。

固相肽合成

多肽合成可以實現自動化，被稱為 Merrifield 固相肽合成，它使用聚苯乙烯固體載體來支撐肽鏈。聚苯乙烯是一種聚合物，其亞基衍生自乙烯基苯。

聚苯乙烯珠在乾燥時不溶且堅硬；然而，它們在某些有機溶劑（例如二氯甲烷）中會膨脹。因此，試劑能夠輕鬆進出聚合物基質。聚苯乙烯上的苯基透過親電芳香取代進行官能化。

File:Electrophilic Chloromethylation of Polystyrene.jpg

以二肽為例，在氯甲基化聚苯乙烯上進行肽的固相合成如下。

1. 連線保護的氨基酸

2. 脫保護氨基末端

3. 與第二個保護的氨基酸偶聯

4. 脫保護氨基末端

5. 將二肽從聚苯乙烯上斷開

二環己基碳二亞胺 (DCC) 的作用

二環己基碳二亞胺 (DCC) 特別用於肽合成，以啟用羧酸根的親電性。這使得 C 端更易於作為其他氨基酸的連線位點。然後，帶負電荷的氧將作為親核試劑攻擊 DCC 中的中心碳。這種中間體最終將轉化為尿素，這是一種穩定的最終產物，在剩餘的肽合成過程中相對不反應。此外，如果未正確監測，DCC 的活化能力有時會使肽鍵外消旋，因此有時可以使用不會外消旋肽立體化學的三唑。

File:Solid-Phase Synthesis of Peptide.jpg

固相合成的優點

固相合成的優點在於，由於所有中間體都固定在聚苯乙烯上，因此可以輕鬆地分離產物。因此，產物可以透過過濾和洗滌進行純化。重複脫保護-偶聯過程能夠合成更大的肽。Merrifield 設計的一臺機器能夠自動執行一系列操作。

保護基團

肽鍵可以由氨基酸主鏈上的羧基和氨基形成。它也可以由側鏈形成以合成不需要的肽。為了合成所需的肽，保護基團用於防止形成不需要的產物。它們還防止反應中使用的過量氨基酸聚合。保護基團還有助於確保某些氨基酸的立體化學保持不變。如果未正確保護，氨基酸的構型可能會發生立體異構體變化或外消旋。

叔丁氧羰基 (t-Boc) 保護基團

它用於保護 N 端氨基以及賴氨酸、精氨酸、天冬醯胺和谷氨醯胺的側鏈。二叔丁基碳酸酯與氨基酸的 NH₂ 反應形成 t-Boc-氨基酸。t-Boc 基團可以在酸性條件下脫除。通常，它們用強酸或三氟乙酸 (TFA)（CF₃COOH）處理。在實驗室中，Boc-氨基酸也可以買到，因為它可以大量合成。合成肽的人不需要自己合成 Boc-氨基酸。固相合成是有效的，因為它允許蛋白質保持在原始結構構型中，而不是被複雜的二級或三級分子間相互作用所影響。