蛋白質組學/蛋白質分離 - 電泳/一維凝膠電泳

十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)

這是一種非常常見的凝膠電泳方法，用於根據質量分離蛋白質。最常用的系統也稱為 Laemmli 方法，以 U.K. Laemmli 命名，他是第一個在科學研究中使用 SDS-PAGE 並發表論文的人。蛋白質溶解在十二烷基硫酸鈉 (SDS) 中，這是一種表面活性劑，可破壞蛋白質之間的相互作用，然後進行電泳。最小的分子更快地穿過凝膠，而較大的分子需要更長的時間，從而導致靠近凝膠頂部的條帶。

凝膠

用於 SDS-PAGE 的凝膠由丙烯醯胺製成，丙烯醯胺形成交聯的聚丙烯醯胺聚合物。標準凝膠通常由兩層組成，最上面的一層稱為堆積凝膠，下面的一層稱為分離凝膠或解析凝膠。堆積層包含低百分比的丙烯醯胺，並且 pH 值較低，而分離凝膠的丙烯醯胺濃度根據待執行的樣品而變化，並且 pH 值較高。堆積凝膠和分離凝膠之間的 pH 和丙烯醯胺濃度差異在分離凝膠中提供了更好的解析度和更清晰的條帶。

程式

樣品用 SDS（十二烷基硫酸鈉）處理，SDS 是一種陰離子去汙劑，透過破壞二硫鍵使蛋白質變性，並根據蛋白質的質量為每個蛋白質提供負電荷。如果沒有 SDS，由於摺疊模式的差異，具有相似分子量的不同蛋白質會遷移不同，因為摺疊模式的差異會導致某些蛋白質比其他蛋白質更容易穿過凝膠基質。SDS 使蛋白質線性化，以便它們可以嚴格地根據分子量分離。SDS 以約 1.4 g SDS/1.0 g 蛋白質的比例與蛋白質結合 [[1]]，為大多數蛋白質提供近似均勻的質量/電荷比，因此可以假設凝膠中的遷移距離與蛋白質的大小直接相關。蛋白質可以進一步用還原劑處理，如二硫蘇糖醇 (DTT) 或 TRP（三丁基膦），以破壞任何重新形成的二硫鍵，然後用碘乙醯胺烷基化以防止二硫鍵的重新形成。可以在蛋白質溶液中新增溴酚藍等跟蹤染料以跟蹤電泳執行過程中蛋白質溶液透過凝膠的進度。

電泳

透過 SDS 變性的蛋白質被應用到浸沒在緩衝液中的聚丙烯醯胺凝膠層的一端。緩衝液提供均勻的 pH 值和離子以傳導電勢。當在凝膠上施加電流時，帶負電荷的蛋白質會穿過凝膠遷移到正極。短的蛋白質更容易穿過凝膠中的孔隙並快速移動，而較大的蛋白質則會遇到更多困難。由於基於它們大小的差異遷移，較小的蛋白質會向下移動得更遠，而較大的蛋白質會停留在起點附近。在一段時間後，蛋白質可能已根據其大小粗略地分離。可以將已知分子量的蛋白質（標記蛋白質）在凝膠的單獨泳道中執行以校準凝膠。

染色和分析

電泳後，可以用考馬斯亮藍或銀染色對凝膠進行染色以使分離的蛋白質視覺化。染色後，不同的蛋白質會根據其大小（因此根據分子量）在凝膠中顯示為不同的條帶。可以根據與已知分子量的標記蛋白質的比較來估計條帶中蛋白質的分子量。可以從凝膠中切下分離的蛋白質，並透過其他蛋白質組學技術進一步分析。

等電聚焦 (IEF)

在等電聚焦中，蛋白質根據其等電點 (pI) 在 pH 梯度中透過電泳分離。在凝膠中生成 pH 梯度，並在凝膠上施加電勢。在除等電點以外的所有 pH 值下，蛋白質都會帶電荷。如果蛋白質帶正電荷，它們會向凝膠的負端移動，如果蛋白質帶負電荷，它們會向凝膠的正端移動。在其等電點，由於蛋白質分子不帶淨電荷，因此它會積累或聚焦成一個尖銳的條帶。

固定化 pH 梯度 (IPG) 和 IEF 執行

固定化 pH 梯度用於 IEF，因為固定 pH 梯度在非常高的電壓下會長時間保持穩定。IPG 的 pH 梯度是透過共價結合到聚丙烯醯胺凝膠中的緩衝化合物生成的。IPG 是具有塑膠背襯層的鑄造條，在不同的 pH 範圍內和長度上是可商購的。它們提供高解析度，良好的可重複性，並允許高蛋白質負載。等電聚焦在用於提取或溶解蛋白質的相同溶液中進行。帶有蛋白質樣品的 IPG 條必須在再水化/樣品緩衝液中再水化，在此期間蛋白質樣品被載入到條帶中。再水化可以是主動的或被動的。為了載入較大的蛋白質，在小電壓下進行主動再水化。隨著樣品進行電泳，蛋白質會根據電荷向陽極或陰極遷移。蛋白質將在達到其各自的 pI 時停止。在 IEF 電泳槽中執行後，蛋白質會根據其等電點聚焦成條帶。聚焦的條帶可以冷凍儲存。

天然 PAGE

非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳 (Native PAGE) 用於根據蛋白質的電荷密度差異分離處於天然狀態的蛋白質。蛋白質的天然狀態是指蛋白質處於正確摺疊狀態，而不是變性或未摺疊狀態。凝膠和緩衝液中不存在變性劑，凝膠中的緩衝液使蛋白質保持其天然狀態。許多蛋白質在透過非變性 PAGE 分離後被證明具有酶活性。因此，它被用於製備純化和活性蛋白質。在非變性 PAGE 中，遷移率取決於蛋白質的電荷和流體力學尺寸。電荷取決於蛋白質的氨基酸組成以及翻譯後修飾。天然蛋白質在凝膠上的流體力學尺寸和遷移率會隨著構象的性質而變化。具有緊湊構象的蛋白質具有更高的遷移率，而較大的結構（如寡聚體）具有較低的遷移率。非變性 PAGE 可在接近中性 pH 的條件下進行，以避免酸性或鹼性變性，從而研究構象以及自締合或聚集，以及其他蛋白質或化合物的結合。儀器保持冷卻以最大程度地減少蛋白質的變性和蛋白水解。

參考文獻