結構生物化學/蛋白質定量

蛋白質定量

在每一步分離後知道蛋白質的量有助於檢查純化的進展並評估技術的效率。蛋白質定量也有助於我們瞭解生物體如何作為一個整體發揮作用。 幾種 色譜 技術 依賴於透過質量對蛋白質進行定量，並使用電荷等其他可觀察量進行進一步區分。

比活力

因為比活力是特定蛋白質的酶促反應與蛋白質總量的比率，所以可以在整個純化過程中對蛋白質進行定量。比活力的方程式可以建模為： ${\tfrac {\color {YellowOrange}total\ enzymatic\ activity}{\color {Green}total\ protein}}$。因此，隨著每一步蛋白質總量的減少，比活力應該上升。通常，進行的測定會給出反應速率，以微摩爾每秒等單位表示。將此速率除以酶製劑的濃度即可得到蛋白質的比活力。

理想情況下，純化的結束應該與恆定的比活力一致。可以透過分析總蛋白質、總活性、產率和純化水平等幾個變數來監測比活力並將其用於量化純化。

產率

可以使用免疫學技術來測量蛋白質的濃度，例如ELISA 或蛋白質印跡（前者能夠測量存在的蛋白質數量，因為試劑與蛋白質之間存在直接比例關係）。

可以使用熒光技術來測量活性。

為了確定在粗提液中每一步連續純化步驟後保留了多少活性，產率可以計算為 ${\tfrac {\color {Purple}new\ activity}{\color {YellowOrange}initial\ activity}}$。為了將其轉換為百分比，將產率乘以 (100)。此外，重要的是要注意，在大多數情況下，初始活性的量始終為 100%。

純化水平

透過獲得純化水平的值，我們能夠評估純度增加了多少。純化水平可以計算為：（${\tfrac {specific\ activity\ calculated\ after\ each\ purification\ step}{specific\ activity\ of\ the\ initial\ extract}}).$

• • • • 重要提示：純化方案只有在同時考慮純化水平和百分比產率時才算成功。如果產率很高而純化程度很低，那麼實驗就會變得相當複雜。這是因為這表明存在大量不感興趣的汙染物/蛋白質。另一方面，如果純化水平很高而百分比產率很低，那麼可以合理地認為沒有足夠的蛋白質可用於進行實驗。

蛋白質總數

使用色譜或透析分離的蛋白質的量由以下公式確定： $(concentration\ of\ protein\ of\ each\ fraction\times fraction's\ total\ volume)$

總酶活性

回收體積的活性由以下公式確定：$(fraction\ volume\times fraction's\ measured\ activity)$

技術

除了電泳和免疫學檢測外，使用硫酸銨，(NH₄)₂SO₄，也可以定量評估純化過程。由於硫酸銨是非變性的，且水溶性極高（在霍夫邁斯特系列中排名很高），因此它被用來有效地沉澱蛋白質：在高濃度下，銨離子和硫酸根離子透過靜電吸引吸收大部分水，使蛋白質聚集並沉澱出來。 ^

蛋白質的質量可以透過沉降平衡技術測量。該方法需要對樣品進行緩慢離心，以建立沉降和擴散之間的平衡。與SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳不同，後者只能估計解離和變性多肽鏈的質量，沉降平衡提供了準確的質量測量，而無需變性，從而使多聚蛋白的天然結構保持完整。此外，根據解離鏈的質量和整個多聚蛋白的質量（分別透過 SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳和沉降平衡測量），可以確定多聚蛋白中每條多肽鏈的複製數。

質譜是另一種用於確定蛋白質質量的準確分析技術。在這種技術中，原子透過機器電離，並透過真空進入檢測器。然後，在電場中的飛行時間 (TOF) 與蛋白質的質量（或質荷比）成正比。因此，蛋白質混合物中質量最小的蛋白質具有最小的 TOF，而質量最大的蛋白質具有最大的 TOF。這種技術允許根據分子的大小和質量來識別和分析分子。然而，這種方法並沒有提供太多關於蛋白質結構或構象的資訊。

參考文獻

1. "第 9 章：蛋白質表達、純化和表徵"，蛋白質：結構與功能，惠特福德，2005 年，約翰·威利父子公司

生物化學，第 6 版，Berg 等人，2007 年弗里曼